实时荧光PCR类

 
1.实时荧光PCR和普通PCR的区别?


普通PCR技术:对反应的终产物进行半定量分析或定性分析。
实时荧光PCR技术:对反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析。是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。
1).实时荧光PCR 在PCR体系中加有SYBR Green或者探针,普通的PCR则没有。
2).实时荧光PCR上机后从电脑上直接读出结果,普通的PCR需要通过电泳分离特定条带,紫外线下或用凝胶成像系统观察和分析结果。

2.实时荧光PCR特点?  

1).灵敏度高;
2).特异性强;
3).PCR实验过程全封闭,无PCR后实验操作;
4).采用dUTP—UNG酶的防污染系统,有效降低污染机率;
5).实时反映扩增过程,更适用于定量;
6).定量范围宽,可达到10个数量级,无需稀释样品;
7).可实现一管多检;
8).仪器自动分析,更快获得结果。

3.在做实时荧光PCR实验时要注意些什么呢?

1).在操作中,应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性移液器吸头(带滤嘴自卸式),不能用手直接触摸八连管,防止PCR实验交叉污染;。在试剂准备和标本处理时应使用生物安全柜(负压式)或防污染罩,以防止对环境的污染。
2).离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用75%乙醇擦拭消毒;每次实验前后用10%次氯酸或75%乙醇擦拭移液器、操作台。
3).实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应该妥善放置,专人保管;废弃物应置专门容器中,妥善处理。
4).荧光探针试剂应避光保存,加入反应液体后,应尽快配置好反应体系进行扩增。
5).配制反应体系时,应注意移液器的使用方法。所有的液体应加样于近液面处;液体的混匀不能使用移液器吹打,避免形成气溶胶污染环境和人员;反应体系配制完毕后低速离心数秒,避免产生气泡。
6).配制反应体系过程中若需标记,请在试管架或离心机管架上标记,不要直接标记在离心管上。
7). PCR反应结束后,不要打开PCR反应管盖,放置在统一的容器密闭销毁。

4.实时荧光PCR实验无Ct值出现,可能什么原因?如何解决?

1).循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号; 
2).检测荧光信号的步骤有误。一般SYBR Green采用72℃延伸时采集,分子信标一般在退火结束时或延伸结束时采集信号; 
3).引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性; 
4).模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起; 
5).模板降解。应避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

5.实时荧光PCR实验无信号出现,可能什么原因?

1).荧光采集通道设置错误;
2).荧光PCR仪光路故障;
3).扩增采集模式设置错误;
4).样本编辑错误。

6.什么原因会造成同一份样品在不同管中的结果差异较大?

1).反应液在管盖或管壁上:在 PCR 加样完成后,最好用微型离心机将PCR反应管点动离心,使反应液沉至管底。因为反应液在管壁或管盖上时,会严重影响实验结果;
2).加样错误:由于加样数量太大,容易造成加样错误,如漏加某管样本或将两个样本加在一个孔中;
3).加样不准确:由于 PCR 反应的加样量都很小,在加入量少于 2µL 时,误差可以达到20%(可以通过万分之一天平来准确定量)。移液器的质量、吸头的质量、枪头的使用次数等都会影响结果,最好使用进口硅烷化的吸头,不要使用清洗后重复的枪头;
4).盖子没有盖紧或忘记盖盖;
5).光盖被污染了:如将编号写在光盖上了。

7.如何控制实验过程中可能出现的假阳性问题?

为尽量避免实时荧光PCR结果出现假阳性:
1).避免实验室环境污染。
2).防止荧光干扰,PCR反应管管壁和管盖应避免用手直接接触,并避免使用任何颜料笔在PCR反应管上标记,实验操作过程中戴一次性无粉手套。
3).实验用的耗材避免污染,离心管、吸头等需灭菌处理。
4).严格按照移液器使用规范操作,轻吹轻吸。
5).防止标本间交叉污染。

8.实验结果的重复性不好可能是什么原因?

1).加样不准确。
2).荧光PCR仪孔间温度条件有差异,即温度均一性不好。
3).样品模板浓度过低。样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

9.什么是背景校正?多长时间执行一次背景校正?

    背 景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间,定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度,信号收集的 温度为60 °C。随后,SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值,提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件,从实验数据中扣除背景信 号。
    因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素(比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等)而变化,所以推荐定期进行背景校正,一般每三个月到半年校正一次。

10.什么是纯荧光校正?多长时间校正一次?

    纯 荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度,通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次 定量实验运行过程中,SDS软件收集样品的原始光谱信号,并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较,精确扣除不同染料的信号重叠部分,从而确定样品中 的荧光染料种类和信号强度。
    推荐每隔半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前,请先进行背景校正和ROI校正。



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